甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物，2021年，全球市场规模超10亿美元的甾体类药物就有5种(https://njardarson.lab.arizona.edu/content/top-pharmaceuticals-poster)。当前甾体工业的初始原料正在由从黄姜等植物中提取的薯蓣皂素转变为油脂工业的下脚料植物甾醇。自20世纪40年代发现有微生物可以降解植物甾醇以来，已有多种微生物报道可以降解植物甾醇得到雄烯二酮(androstenedione, AD) 等化合物，如：分枝杆菌(Mycobacterium sp.)[1-2]、红球菌(Rhodococcus sp.)[3-4]、诺卡氏菌(Norcardia sp.)[5]和假单胞菌(Pseudomonas sp.)[6-7]等。在20世纪60–90年代，科研人员通过传统诱变筛选技术和添加抑制剂抑制关键酶活力等方法，开发了一系列制备AD、雄二烯二酮(androstadiendione, ADD)、9α-羟基-雄烯二酮(9α-hydroxy-androstenedione, 9α-OH-AD)[8]和谷内酯(sitolactone, HIL)[9]的菌株及转化工艺，这些化合物是合成甾体药物的关键中间体，全球年需求量约3 000 t。但由于甾体代谢途径复杂，中间代谢产物和副产物众多(图 1)，且甾体化合物性质相近，难以分离纯化，导致AD、ADD等重要甾体药物核心原料价格高昂，使得我国甾体药物关键原料一直依赖黄姜种植、从薯蓣皂素合成甾体药物原料药的格局没有被打破。植物甾醇替代薯蓣皂素作为甾体药物关键中间体的来源是有效解决黄姜种植、提取薯蓣皂素及后期化学加工生产过程中占用耕地、“三废”排放量大、环境污染严重等问题的有效策略和手段[10]。通过基因工程、合成生物学技术方法对野生菌进行改造，从而获得高转化率、高产物纯度的新菌株，及转化过程优化等成为科学界和甾体药物行业的研究热点[8]。
图 1 植物甾醇代谢途径[8, 11]
Fig. 1 The metabolic pathway of phytosterol[8, 11].
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1 国内外植物甾醇转化为甾体药物中间体菌种的构建及转化体系优化 植物甾醇作为食用油工业的副产物，具有来源广泛、价格低廉等优点。21世纪以来，随着甾醇代谢途径及相关基因簇的解析，代谢工程和合成生物学等方法应用于甾体药物关键中间体生产菌株构建，新一代基因工程生产菌逐渐应用于甾体药物关键中间体的生产。
1.1 甾体药物关键中间体生产菌株改造 在AD菌株构建方面，José L. García等在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 中敲除9-羟化酶的B亚基(kshB) 和1, 2-脱氢酶(kstD) 基因，构建了基因工程菌，当底物浓度为10 g/L时，88%–90%的底物甾醇转化为产物AD，但同时有10%–11%的底物转化为副产物22-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮(22-hydroxy-23, 24-bisnorchol-4-ene-3-one, BA)[12-14]。在ADD菌株构建方面，同样是José L. García等在M. smegmatis中敲除kshB后，当底物浓度为20 g/L时，55%–70%的底物甾醇转化为产物ADD，有22%–30%转化为副产物AD，同时还检测到其他副产物[12]。在9α-OH-AD菌株构建方面，华东理工大学魏东芝教授团队通过敲除新金黄分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum) ATCC 25795的1, 2-脱氢酶，增强表达9-羟化酶，构建的工程菌在底物浓度15 g/L时，9α-OH-AD达到7.3 g/L，同时含有0.3 g/L的AD，摩尔产率达到67%[15]。在BA菌株构建方面，同样是魏东芝教授团队通过敲除同一株M. neoaurum的β-OH-乙酰辅酶A脱氢酶(hsd4A) 基因构建了产BA的菌株，底物浓度40 g/L时，BA的摩尔转化率达47%–49%，但同时有少量AD、22-羟基-23, 24-二降胆-1, 4-二烯-3-酮(22-hydroxy-23, 24-bisnorchol-1, 4-dien-3-one, DBA) 等副产物[16]。积累HIL的菌株一直是通过诱变及筛选获得的，Nakamatsu等利用珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline IFO 3338) 突变株进行谷内酯生产，但摩尔产率只有25%[17-18]。Ferreira等利用澳大利亚红球菌(Rhodococcus australis CSIR-236.457) 突变株制备谷内酯时，摩尔产率可达60%，当底物浓度在6–12 g/L时，摩尔产率约为63%，但底物浓度升高至15 g/L时，摩尔产率降为48%–57%[9]。
中国科学院天津工业生物技术研究所前期筛选到了一株可产BA和DBA的分枝杆菌(Mycobacterium sp.) CGMCC NO.13234[19-20]，在此基础上对基因组进行测序并重构甾醇代谢途径，除已经报道的kshAB、kstD和hsd4A外，陆续发现17β-羟基甾体脱氢酶基因(17β-hsd)、羟醛裂解酶基因(halT和ltp2)、羧酸还原酶基因(car1和car2) 影响AD、ADD、9α-OH-AD和HIL的纯度和产量[21]。此外，增强表达3β-甾体脱氢酶基因(3β-hsd) 可加速甾醇的代谢，由此构建了具有自主知识产权的生产甾体药物核心原料(AD、ADD、9α-OH-AD、HIL和BA) 的菌种，并于2021年9月通过浙江省科技厅组织的技术鉴定。
1.2 菌种高效转化植物甾醇体系的构建 在植物甾醇的降解、转化过程的一系列关键酶都是胞内酶，植物甾醇需要穿过细胞膜才能进入胞内。然而在常规的水相发酵体系中，植物甾醇的溶解度仅为0.1–1.0 mmol/L，导致菌体对底物的摄入严重不足，这也是严重制约植物甾醇转化为甾体药物关键中间体技术应用的因素之一。
科研人员在提高膜通透性及通过反应体系提高底物溶解度方面开展了研究工作，在一定程度上提高了菌株转化植物甾醇的效率。高兴强等在使用分枝杆菌代谢植物甾醇合成9α-OH-AD的反应中，使用大豆油(添加浓度为25%–30%) 和葵花籽油等，增大了底物的分散性更利于底物的转化[22]。Smith等利用Mycobacterium sp.代谢胆固醇，在培养体系中添加2%的Tween-80与胆固醇浑浊液，使达到同样效果的代谢时间缩短2–3 d[23]。Korycka-Machala等的研究表明聚阳离子(例如鱼精蛋白) 能增加不溶于水性物质对分枝杆菌细胞膜的渗透，当发酵液中添加鱼精蛋白时，β-谷甾醇的代谢速率提高了3倍[24]。周龙飞等将非离子表面活性剂壬基酚乙氧乙烯醚(TX-40) 用于Mycobacterium sp. LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD，使9α-OH-AD的摩尔得率较添加18%大豆油时提高了11.0%[25]。许桠楠等考察不同助溶剂与TX-40复配对菌株转化植物甾醇的影响，并通过正交实验的方法确定最适的复配比例。进而尝试添加分枝杆菌细胞膜的抑制剂，建立有利于分枝杆菌转化植物甾醇的两相转化体系，进一步提高分枝杆菌转化植物甾醇生成目标产物的能力[26]。
大规模工业化生产大多以植物油来提高植物甾醇的分散性，从而提高投料浓度和生产强度。该工艺简单、稳定、可操作性强，但也存在有机溶剂使用量大、分离纯化工艺复杂、难以实现自动化和连续化等不足。结合自身菌种特点，中国科学院天津工业生物技术研究所与浙江仙居君业药业有限公司的科研人员一起建立了植物甾醇微油转化生产工艺，大幅提升了植物甾醇的底物投料浓度，并以此为基础建立了连续生产工艺，摩尔产率达75%–90%，发酵萃取液产物纯度不低于92%，生产强度可达200–300 g/(m3·h)，大幅提高了菌株的时空转化率和生产强度。
2 系列植物甾醇转化生产甾体药物中间体菌种的智能化产业实施 在2012年之前，浙江仙居君业药业有限公司受困于技术方面的因素，公司生产甾体药物的基础核心母核原料是外购的双烯。双烯以种植的黄姜为起始原料，经强酸分解提取薯蓣皂素后，通过化学裂解的方式制取，生产过程中产生大量的强酸废水，处理成本很高。随着国家环保要求的日益提高，造成了双烯原料供应不足，价格飞涨，降低了公司的市场竞争力。
浙江仙居君业药业有限公司与中国科学院天津工业生物技术研究所合作，提前布局，组建甾体生物转化联合实验室，开展生物合成技术转化植物甾醇生产AD等甾体药物基础母核原料的研发攻关工作，突破了AD等菌种构建和生物转化工艺，获得独立知识产权菌种。在此技术基础上，融合自动化、数字化、信息化技术，成功建成了国内首创、国际领先的甾体药物核心原料柔性智能生产线，实现了甾体母核到原料药(去氢表雄酮，DHEA) 全产业链的高效生物催化生产装置，突破了甾体药物制造过程中的高耗能、高污染瓶颈，建成了一座年产千吨级的甾体核心原料药关键中间体的绿色生物制造的智能工厂(图 2)。
图 2 浙江仙居君业药业有限公司甾体核心原料生产中央控制室(A) 及车间(B)
Fig. 2 Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co. Ltd. central control room (A) and the production workshop (B) for the steroidal key intermediates.
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2.1 项目应用情况 “甾体药物核心原料的数字智能化绿色生物制造”项目是所企双方发挥各自优势十年通力合作的结晶。该项目于2019年列入国家发改委和工信部技术改造项目，2020年被认定为浙江省甾体药物智能工厂。目前，该项目已投资2.6亿元，其中智能化设备投资达2亿元，实现了AD、9α-OH-AD、BA等五大关键甾体药物中间体的发酵车间、提取车间、动力车间和罐区、环保站的全程自动化、绿色化，形成了年产1 000 t核心原料的生产能力，新增产值10亿元。这也是国内唯一一家甾体药物核心原料的自动化生产工厂。
2.2 项目的示范作用 君业药业攻克医药产业数字化转型的难题，依托工业APP、工业互联网平台和数据源，从价值链、业务链、数据链3个维度打造年产千吨级的甾体药物“智能工厂”，大步迈向“新智造”、迈向“未来工厂”。在工业互联网平台中设置生产原料供应模块、工艺监控模块、能耗监控模块等9大模块，实现从原料采购、入库到过程使用、产出、质量情况的全流程数据贯通，以“透明工厂”优化企业日常运营和管理。攻克了复杂分子药物原料生物法合成的核心关键技术，首创数字智能化连续发酵、连续提取的自动化工艺，解决了高浓度连续投料、细胞活性稳定、产物抑制即时解除等难题，实现参数调控、物料转移、设备清洗等各项操作的“一键式”远程控制，显著提高了生产效率和生产集约化水平，提高生产效率，降低人工成本。对每台设备进行精细化管理，通过大数据分析进行预防性维保，大幅降低设备故障停机频率，减少维护成本，提高设备维护人员工作效率。同时，对能耗成本展开精细化管理，制定水、电、汽全维度用能统计分析报表，通过数据分析优化生产过程控制、热量回收等措施，不断优化企业用能管理，实现低碳生产。
本项目为医药化工绿色转型升级做出了示范。台州地区山清水秀，但医药化工产业集中。本项目建成了国内首个药物发酵、提取、精制全流程自动化、连续化生产的智能工厂，率先实现甾体药物中间体的清洁生产。与行业现行工艺相比，本项目实现了“一高五低”：即生产效率提高50%、挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOC) 排放减少70%、废水排放减少30%、发酵菌渣降低40%、能耗减少40%、人工降低70%。本项目为医药化工通过生物制造实现绿色化生产做出了示范，是生物技术-信息技术(biotechnology-information technology, BT-IT) 结合的经典案例。
本项目解决了区域甾体医药产业发展原料供应瓶颈问题。台州地区作为国家科技部批准的唯一的甾体类药物产业基地，各类甾体药物生产企业数十家，甾体激素原料药产能约占全球30%的份额以上。目前甾体药物起始原料供应问题严重制约了台州地区甾体医药行业各家企业的产品竞争力，君业药业有限公司千吨级核心甾体药物起始原料项目的投产，彻底解决了台州地区甾体药物生产企业的原料供应的瓶颈问题，将大大提升区域企业的产品竞争力，促进台州地区甾体药物生产基地做大做强。
本项目提高了国家甾体药物产业安全性。作为国内唯一一家具有完整知识产权的甾体药物起始原料生产线，实现了甾体药物5大关键原料中间体的全覆盖、共生产线、高质量生产，生产工艺、环境保护、产品质量等指标均达到世界一流水平，能满足国内甾体药物起始原料50%的市场需求，有力地保障了我国甾体药物供应链的稳定与安全。
3 展望 我国甾体药物关键中间体生产方式正在快速由以黄姜等植物提取改造薯蓣皂素结构的化学法转变为生物转化植物甾醇(油脂工业副产物) 制造法，逐步实现了初始原料的替代。在这一技术替代的过程中，中国科学院天津工业生物技术研究所针对国家、市场和企业的实际需求，开发了系列甾体药物中间体转化菌株，有效保证了我国甾体药物原料供应的安全，也助力企业提高了市场竞争力及发展壮大。
我们将利用调控元件对传统甾体药物中间体生产菌株继续优化，提高摩尔产率和时空产率，有效降低生产成本，使企业的智能化生产工厂发挥出最大作用。我们也将与有机合成等领域的专家密切配合，基于重要甾体药物分子的逆合成分析，利用合成生物学关键催化元件，构建更适于甾体原料药合成的新一代中间体生物转化菌株，降低化学合成难度，建立更绿色环保的新合成工艺。同时，我们也将与企业深入合作，将数字信息技术应用于生物发酵转化过程，提高菌株的鲁棒性，使生产菌长时间保持高活力状态，大幅降低生产成本，实现最大程度的“节能减排”。合成生物学的发展，有可能实现从葡萄糖等简单原料到甾体关键中间体乃至甾体原料药的直接生物合成，彻底颠覆甾体药物的生产范式。
“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”。在甾体药物关键中间体的生物制造方面，我们将奋笔疾书属于这个时代的华彩篇章。